Молекула жизни

В мифах Древней Греции химера — это чудовище с головой льва, туловищем козы и хвостом в виде змеи. Ученым идея понравилась, и они решили создать химерные (рекомбинантные) ДНК, состоящие из фрагментов нуклеиновых кислот разных организмов [1], [2]. Зачем? Чтобы передать одному организму признак другого. Например, встраиваем ген морозоустойчивости камбалы в клубнику — и она больше не боится заморозков. Здорово?

1972 год, Стэнфордский университет, США. В лаборатории биохимика Пола Берга получили первую рекомбинантную ДНК [3]. Это стало революцией, положившей начало эре генной инженерии. Эре помидоров с геном скорпиона и рыбок с генами медузы. Эре, где дерзкий человек станет творцом живых организмов. Станет богом?

Но это все впереди. А пока Бергу удалось получить крошечную молекулу, состоявшую из «кусочков» ДНК разных организмов, словно лоскутное одеяло. Как же ему это удалось?

 

Отец генной инженерии

Берг взял «лабораторную мышку» микробиологов — кишечную палочку (Escherichia coli), поражающий ее бактериофаг λ и полиомавирус SV40, вызывающий опухоли у мышей. Затем с помощью фермента рестриктазы разрезал ДНК этих организмов. В результате на концах фрагментов ДНК он получил «липкие концы» (выступающие концы, которые являются комплементарными, то есть могут соединяться друг с другом). Такие «липкие концы» (рис. 1) притягиваются друг к другу, словно липучки на сандалике, и соединяются водородными связями. В этом им помогает другой фермент — ДНК-лигаза. С помощью этих ферментов (лигазы и рестриктазы) Бергу удалось получить первую в мире гибридную ДНК. Она состояла из фрагмента ДНК бактериофага λ, группы генов кишечной палочки (E. coli), ответственных за сбраживание сахара галактозы, и полной ДНК вируса SV40. Эта рекомбинантная ДНК теоретически могла бы проникать и в бактерию, и в животное, и обладать при этом функциональной активностью в их клетках (ДНК бактериофага обеспечивает ее способность самокопироваться в клетках кишечной палочки, а ДНК SV40 — в клетках обезьяны). Однако именно это экспериментально Пол Берг не проверил. Но и создания рекомбинантной ДНК было достаточно, чтобы его назвали «отцом генной инженерии». Внешне рекомбинантная ДНК ничем не отличается от нерекомбинантной, и только ее создатель знает, что это гибрид, да еще такой, какого не смогла сотворить даже неистощимая на выдумки природа [3].

Мне мало бактерий, давайте конструировать растения!

Человек всегда пытался улучшить природу. Он хотел получить растения с самыми красными помидорами и самой сочной клубникой. Сначала он это делал неосознанно — например, отбирал для посева наиболее крупные семена пшеницы. Затем уже сознательно — скрещивал растения одного вида, затем отбирал экземпляры, которые обладали полезными качествами, и скрещивал уже их. Это селекция. А что если комбинировать гены на молекулярном уровне? Не надеяться на слепой случай, а целенаправленно выращивать растения с уже заданными свойствами?

Запрограммируйте мне розу с голубыми лепестками, пожалуйста!

И еще фиолетовую картошку — хочу необычным пюре мужа удивить.

Казалось бы, в чем проблема, давайте по аналогии с трансгенными бактериями получим трансгенные растения. Но не все так просто. Одно дело, одноклеточная микроскопическая бактерия, у которой даже ядра нет. Совсем другое — сложно устроенное многоклеточное растение. Как же нам ввести новый ген в каждую его клетку? Ведь дополнительные трудности создает наличие плотной клеточной оболочки. Но тут генетикам повезло. Растения в этом плане имеют одно важное преимущество перед животными — им свойственна тотипотентность (от лат. totus — весь, целый; и potentia — сила). Это страшное слово означает способность отдельных клеток к развитию в целое растение [5]. То есть можно встроить ген другого организма только в одну клетку, а затем вырастить из нее целое растение.

Перед учеными встала новая задача — найти подходящее «такси» (вектор) для доставки нужного гена в растительную клетку. И тут на помощь дерзким демиургам пришла сама природа. Наверняка вы видели галлы, образующиеся на деревьях, — выросты своеобразной формы на листьях, стеблях, почках. Вызвать эти образования могут вирусы, бактерии, грибы, клещи. Но биотехнологов интересовали именно корончатые галлы (рис. 2а и 2б), которые впервые описали еще древние греки. Это настоящие злокачественные опухоли, которые образуются на стеблях или листьях многих двудольных растений. Клетки корончатых галлов приобретают способность неограниченно размножаться, оставаясь недифференцированными [6].

Для того чтобы перенести гены 

Rhizobium radiobacter, вовсе необязательно иметь дело с целым растением. Достаточно выдержать некоторое время бактерии совместно с протопластами растительных клеток (то есть клетками, лишенными клеточной стенки). Такие «голые» клетки более беззащитны, и ДНК бактерий проще проникнуть в них, чем в «одетые» клеточной стенкой. Далее из таких «трансформированных» протопластов получаем целые клетки, помещаем их на питательную среду (например, на основе знакомого всем любителям мармелада агар-агара). После этого остается только перенести сосуды с клетками в темное помещение и поддерживать нужные температуру и влажность. Через несколько недель образуется каллусная культура. Затем регенерируем побеги, укореняем их и получаем трансгенное растение (рис. 4).

Методы демиургов

А что, если просто пробить дыры в клеточной мембране, через которые смогут беспрепятственно пройти «чужие» ДНК? «Хорошая идея!» — подумали ученые и поместили раствор с живыми клетками и дополнительными молекулами ДНК в пластиковые кюветы с алюминиевыми электродами. Затем с помощью импульсов высокого напряжения создали в мембранах клеток временные крошечные поры, сквозь которые «чужие» ДНК проникают в клетку. Через некоторое время поры закрываются и клетки остаются целыми и невредимыми, но уже «трансформированными», то есть с чужой ДНК. Этот метод называется электропорацией и является наиболее простым и эффективным методом введения молекул ДНК в клетки. Но до недавнего времени его использовали только в немногих российских лабораториях. Почему? Все просто: далеко не в каждой лаборатории был достаточно дорогой прибор — электропоратор (рис. 5).

«Если хочешь сделать что-то хорошо — сделай это сам», — подумал А. Грессман в 1970 году. И ввел в клетку немного жидкости (около 10-8 мкл раствора с ДНК) с помощью стеклянного микрокапилляра. Этот метод называется микроиньекцией, его достоинство — возможность ввести ДНК в конкретную часть клетки (например, ядро). Эксперимент проводится на предметном столике микроскопа с применением микроманипуляторов и микрошприцев (рис. 6).

В качестве маркера для растительных клеток

Но какой бы метод мы не применяли, добиться 100-процентной эффективности не удастся. А значит, надо как-то отделить трансформированные клетки от остальных, и создать благоприятные условия для их деления и развития. Для этого в клетку вместе с «целевым» геном (геном, несущим нужный нам признак, например морозоустойчивость) надо внести маркерный ген. Для бактерий обычно используют ген устойчивости к антибиотикам. Потом помещают клетки на питательную среду с антибиотиком, где способны расти только трансформированные клетки.

А что же использовать в качестве маркера для растительных клеток? Чаще всего используют два гена [7], [9]:

• глюкуронидазы (из бактерий), которая окрашивает трансформированные клетки в тёмно-синий цвет, но при этом они погибают (рис. 8);
• зелёного флуоресцентного белка (из медузы или светлячков) (рис. 9), который светится при освещении ультрафиолетом, а клетки остаются живы.

ГМО выходит на рынок

Итак, ученые нашли способ вводить гены других организмов в растения. Если бы вы были фермером и узнали об этом, какова бы была ваша реакция? Наверное, закружилась бы голова от открывающихся перспектив. Неужели действительно можно создать растения, устойчивые к холоду, засухе, не подверженные вредителям? Не нужны больше дорогие и токсичные гербициды, не будет катастрофических потерь урожая из-за капризов природы.

Формальной датой рождения генной инженерии растений принято считать 1982 год, когда Д. Кемп и Т. Холл в США получили первое в мире химерное растение — санбин. В геном подсолнечника с помощью знакомой нам Ti-плазмиды перенесли ген запасного белка бобовых фазеолина. Таким образом удался перенос гена между растениями, относящимися к различным семействам [10].

Ученые ликовали, а обыватели смотрели с подозрением — так стоит ли допускать такую еду на рынки или пусть остается в области чисто научных исследований?

Первыми рискнуть решили США. После прохождения всех необходимых тестов в 1994 году в продаже появилась первая генномодифицированная еда. Это были томаты Flavr Savr (рис. 10) (от англ. flavor saver — сохранитель вкуса). Обычно в процессе созревания плоды томатов постепенно теряют упругость, становятся мягкими и загнивают. Причиной этого является фермент полигалактуроназа, которая расщепляет пектин (полисахарид, структурный элемент растительных клеток). Что же делать? А если просто выключить ген, кодирующий этот фермент? Для этого создали трансгенные растения, в которых синтезировалась антисмысловая РНК-версия этого гена (эта асРНК соединяется с мРНК и физически препятствует формированию трансляционного комплекса — механизм синтеза полигалактуроназы нарушен). В результате у полученного сорта полигалактуроназа образовывалась в пониженном количестве, благодаря чему спелые помидоры дольше сохраняли товарный вид. Однако при выставлении на продажу такие томаты были восприняты без энтузиазма. Дело в том, что помидоры Flavr Savr оказались совершенно безвкусными [11]. Это была не самая удачная попытка, но маховик генномодифицированной еды уже был запущен. И новые трансгенные продукты на прилавках не заставили себя долго ждать.

Зайдите в ванную, возьмите любой из стоящих на полочке флакончиков и почитайте этикетки. Шампунь, гель для душа, стиральный порошок, зубная паста — не важно, в описании состава вы, скорее всего, найдете производные лавровой (додекановой) кислоты. Как вы, наверное, догадываетесь, ее можно выделить из лавра благородного, вечнозеленого дерева субтропиков. Но он дает мало семян, их трудно собирать и перерабатывать. Сегодня лавровую кислоту получают, в основном, из масла гвинейской масличной пальмы. Но она растет исключительно в тёплом влажном экваториальном климате и не размножается вегетативно. Поэтому развитым странам необходимо иметь какой-то альтернативный источник лавровой кислоты. На помощь пришли молекулярные биологи. Они выбрали самую рентабельную масличную культуру для умеренной зоны Северного полушария — масличный рапс. Важно, что его можно вырастить в течение одного сезона. Но, к сожалению, лавровой кислоты в этой культуре незначительное количество. Значит, надо было получить трансгенный рапс с повышенным содержанием лавровой кислоты. Для этого из калифорнийского лавра выделили ген, ответственный за синтез этой кислоты. После пересадки этого гена в генетически модифицированном рапсе два из трех остатков жирных кислот в составе масла оказались представлены лавровой кислотой. В 1995 году закончилась экспериментальная проверка, и было получено разрешение от властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса [11], [12].

Вирусы, растения и человек — кто кого?

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям. Вирусы — давние враги фермеров, ведь поражение растений вирусами уменьшает урожай в среднем на 30%. Как с этим бороться? Можно использовать химические средства защиты. Но они негативно влияют на окружающую среду, животных, здоровье человека. Ежегодно в мире ВОЗ регистрирует до полумиллиона случаев отравления людей пестицидами. Попробуем другой путь?

Современные технологии создания устойчивых к вирусам сортов растений основаны на использовании известного с незапамятных времен метода, получившего название перекрестной защиты (cross protection). Он основан на явлении повышенной устойчивости растений к агрессивным формам какого-либо вируса при условии, что оно было ранее заражено менее вредоносной формой того же самого вида вирусов. Механизм этого явления точно не выяснен, однако его достаточно широко используют в Японии для защиты томатов от поражения вирусами томатной и огуречной мозаики, в Бразилии — для защиты цитрусовых, папайи, кабачков цуккини и т.д.

В 1986 г. П. Абель с сотрудниками впервые получил устойчивые к вирусу табачной мозаики растения табака путем переноса в их геном гена этого вируса, кодирующего образование белка оболочки [13]. Подход успешно опробовали на многих растениях. Но для коммерческого использования допущены немногие: папайя, две формы цуккини, сорта картофеля.

Генетически модифицированные джинсы

Но растениеводам приходится бороться не только с вирусами, но и с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур. Насекомые, как и любые другие живые существа, болеют. Одно из заболеваний насекомых вызывает бактерия тюрингская палочка (Bacillus thuringiensis). Она выделяет белок, нарушающий пищеварение у насекомых (Bt-токсин) и при этом обладающий высокой избирательностью действия. Это означает, что Bt-токсин, выделенный из определенного штамма бактерий, способен убивать определенный вид насекомых (например, жуков). Как же он это делает? Если Bt-токсин попадает в пищеварительный тракт чувствительного к нему насекомого, то под действием протеолитического фермента от него отделяется небольшая часть (активная форма этого белка). Она прикрепляется к специфическим рецепторам пищеварительного тракта насекомого и вызывает лизис (растворение) клеток. Насекомое перестает питаться, происходит обезвоживание организма и в конце концов бедняга погибает. А что будет, если Bt-токсин попадет в нечувствительный к нему организм? Да ничего особенного — этот токсин просто переварится. Со школьных уроков биологии вы, скорее всего, помните, что строения пищеварительного тракта насекомых и человека сильно различаются, да и ферменты разные. Поэтому людям не стоит бояться Bt-токсина — для них он абсолютно безопасен.

Из бактерий выделили ген, отвечающий за синтез Bt-токсина, и внедрили его в геном растений. С 1997 года в Китае начали выращивать генетически модифицированный хлопчатник, устойчивый к вредителям (в частности — к хлопковому долгоносику). В итоге повысились урожаи хлопка и резко сократилось использование химических пестицидов, что значительно улучшило экологическую обстановку в сельскохозяйственных районах Китая. В Индии — одной из лидирующих стран-производителей хлопка — сегодня около 90% площадей заняты генетически модифицированным хлопком [14]. Значит, если вы носите джинсы — 9 из 10 шансов, что генетически модифицированные. И ничего страшного, правда?

Среди Bt-растений, продаваемых в США, преобладают хлопок и кукуруза, а также устойчивый к колорадскому жуку картофель [10–12].

Бизнес и ничего личного

Одной из основных проблем сельскохозяйственного производства является борьба с сорняками. В развитых странах для этих целей широко применяют гербициды. При этом возникает проблема защиты культурных растений, неустойчивых к этим гербицидам. Первое место среди гербицидов по производству в мире занимает глифосат. Его выпускают под названиями «Раундап», «Глифор», «Торнадо» и «Ураган». Этот гербицид разработала скандально известная транснациональная компания Monsanto. И ученые этой компании нашли возможность защитить полезные растения от своего гербицида — чего не сделаешь ради бизнеса?! Как же им это удалось?

Гербицид глифосат относится к гербицидам сплошного действия. Его мишенью в растении является фермент 5-енолпирувил-шикимат-3-фосфатсинтаза (EPSPS), который играет важную роль в синтезе ароматических аминокислот. Под действием гербицида у неустойчивых к нему растений наблюдаются симптомы азотного голодания, и они погибают. Ученые выделили ген этого фермента из агробактерии (уже знакомой нам Rhizobium radiobacter) и заменили в его структуре одну аминокислоту в области, где происходит его связывание с гербицидом. В итоге — глифосат не может дезактивировать такой мутантный фермент. Ген встроили в сою (рис. 11), и такая гербицидоустойчивая соя стала одним из первых трансгенных растений. Она продается под торговой маркой «Раундап Рэди» (что означает «Готовая к „Раундапу“»). Генетически модифицированная соя разрешена к импорту и использованию для пищи в большинстве стран мира и является безусловным лидером среди всех трансгенных культур.

Ассорти трансгенных растений

Перспективным проектом является создание сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям [15]. Например, получили устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона [16]. Создали «помидор с жабрами» — помидор, в который для увеличения морозоустойчивости встроили ген североамериканской плоской рыбы камбалы [16]. Надеемся, вы уже поняли, что никаких жабр у данного помидора нет, просто в его геном встроен маленький кусочек рыбьей ДНК. А вот журналисты, которым лень разбираться в принципах создания ГМО, даже окрестили этот трансгенный помидор «завтраком Франкенштейна». Но вы, как внимательные читатели, не будете же говорить как в анекдоте «не буду есть трансгенные растения: там есть гены, а в обычных — нет».

Внимание ученых привлекает также идея использования трансгенных растений в качестве биореакторов для производства ценных фармацевтических соединений [4]. Созданы растения табака с человеческим интерлейкином 10 (стимулятором иммунитета) [12], [17].

В цветоводстве активно используют получение трансгенных растений с измененными декоративными свойствами. С помощью генов, отвечающих за разные пигменты, выращивают петунии с разноцветными цветками. В 2004 году получили сорт роз Blue Moon с геном пигмента дельфиниума [11]. Синяя роза, издавна встречающаяся в произведениях литературы и искусства как символ недостижимого идеала, стала реальностью?

Трансгенное будущее

Трансгенные растения уже прочно вошли в нашу жизнь. В период с 1996 по 2012 гг. общая площадь посевов трансгенных культур в мире выросла с 0 до 180 млн гектаров. В 2013 году развивающиеся страны обогнали промышленно развитые по площади возделывания трансгенных культур. Лидером оказалась Бразилия, до этого лидировали США. Основные трансгенные культуры — это соя, кукуруза, хлопчатник и рапс. Всего сейчас на рынок допущено 28 трансгенных культур, а в следующие пять лет ожидается получение разрешений еще на 85. К производителям ГМ-продуктов относятся такие известные компании как Heinz, Coca-Cola, PepsiCo, Mars, Cudbury, Lipton, Calve, Nescafe, Maggi, Nestle, Nesquik.

Транснациональная корпорация «Монсанто» — лидер по производству и продаже семян трансгенных культур. Ее называют самой ненавидимой корпорацией в мире. Регулярно проходят марши и митинги против этой компании и ГМО в целом. Новые болезни, мутанты, суперсорняки, конец эволюции — что это: ГМО-страшилки или реальная угроза?

Как только была создана первая рекомбинантная ДНК, человек почувствовал, что, возможно, переходит черту. Создал то, о чем раньше мог только мечтать, — и испугался.

Ученые, в том числе и сам Пол Берг, в 1974 году опубликовали в журнале «Сайенс» письмо с просьбой приостановить работы по генной инженерии до выявления безопасности трансгенных организмов и разработки правил безопасности работы с ними [19]. Чего же они боялись? Эпидемий неизвестных болезней, нарушения равновесия в природе, бесконтрольного размножения трансгенных организмов, хаотичного переноса генов. Неужели Пол Берг стал вторым Робертом Оппенгеймером и создал свою «атомную бомбу»? Может, правильным было бы окончательно запретить любые манипуляции с генами? Дерзкий человек бездумно вторгается в хрупкое равновесие природы — приведет ли это к чему-то хорошему?

 

Эти вопросы задавали ученые — передовая часть общества, что уж говорить об обывателях. Работы по созданию трансгенных организмов приостановили законодательно в том же 1974 году. Возникали различные дискуссии ученых на данную тему, эксперименты продолжали проводить лишь в специальных, хорошо защищенных сооружениях.

Но ничего страшного не произошло. В итоге в 1976 г. запрет сняли после разработки правил и техники безопасности работы.

Мнения ученых о безопасности генетически модифицированных источников питания расходятся. Указывают на следующие биологические риски использования ГМО [10-12], [14], [20]:

1. Аллергические и токсические эффекты трансгенного белка. Однако появление в пище любого нового белка (не обязательно трансгенного) у чувствительных людей также может вызвать аллергию или снижение общего иммунитета.
2. Невозможность предсказания исследователями того, в каком месте произойдет вставка чужеродной ДНК, и невозможность предвиденья последствий этого. Долгое время это было непреодолимой трудностью, однако современная технология CRISPR-Cas позволяет точечно изменять ДНК и решает эту проблему [21], [22].
3. Плейотропный эффект встроенного гена. Фрагмент чужеродной ДНК может непредсказуемо изменить интенсивность экспрессии соседних генов («включить» ранее молчащие гены или «выключить» работающие), что приведет к изменению клеточного метаболизма.
4. Риск передачи заданных свойств сорнякам.
5. Влияние на биоразнообразие планеты.
6. Потенциальная опасность для здоровья человека путем переноса встроенного гена в микрофлору кишечника или образования из модифицированных белков под воздействием нормальных ферментов так называемых минорных компонентов, способных оказывать негативное влияние. Конечно, при питании человека или животных такими продуктами генетический аппарат растений должен разрушаться в кишечнике, однако вдыхание пыльцы этих растений теоретически может отрицательно повлиять на организм.

Действующая в России система контроля ГМО считается одной из самых жестких. Российские производители обязаны маркировать продукты, если содержание ГМО превышает 0,9%. А например, в Японии — 5%.

Сегодня в Россию можно ввозить и использовать в пищевых технологиях 16 сортов генетически модифицированных растений. Это кукуруза, соя, картофель, сахарная свёкла, рис. От 30 до 40% продуктов на современном рынке уже содержат компоненты, полученные из ГМО. Парадоксально, что при этом выращивать генетически модифицированные растения в России долго не разрешалось. 23 сентября 2013 г. вышло постановление, разрешающее выращивать трансгенные растения. Это постановление вступило в силу с 1 июля 2014 г. А первый урожай генномодифицированных зерновых планировали собрать уже в 2017 году. Однако в июле 2016 года вступил в силу новый закон, запрещающий выращивать на территории РФ растения и животных для производства продуктов питания. Теперь ГМО можно выращивать только в научных целях, а для питания необходимо ввозить ГМ-продукты из-за границы.

Вместо заключения

Наталья ВиноградоваНаталья Виноградова Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького

Установить 100-процентную безопасность любых пищевых продуктов научно невозможно. Однако генетически модифицированные продукты проходят множество подробных исследований. Пятнадцатилетний опыт стран, производящих трансгенные растения, показывает, что эти растения вполне безопасны . Человеку свойственен естественный страх перед переменами, но прогресс не остановить. А вот стоит ли лично вам есть продукты с ГМО — «думайте сами, решайте сами...»

Конкурс «био/мол/текст»-2017
Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.